雄性不育在开花植物中普遍存在，主要表现为雄蕊发育不正常，不能产生具有正常功能的花粉［1］。‘无子瓯柑’Citrus suavissima‘Seedless’是瓯柑Citrus suavissima的芽变品种，保留了瓯柑肉质饱满、香味特异、耐储藏的优良品质，因果实无核被人们青睐。研究认为，雄性不育是 ‘无子瓯柑’无核的重要原因之一［2］。张迟等［3］发现 ‘无子瓯柑’花粉败育始于小孢子母细胞时期，推测其雄性不育与能量代谢异常和营养物质缺乏有关。对矮牵牛Petunia hybrid［4］，枸杞Lycium barbarum［5］，辣椒Capscum annuum［6］和萝卜Raphanus sativus［7］等植物的研究发现， 查尔酮合成酶基因（CHS）的异常表达会引起雄性不育；CHS是黄酮类化合物代谢通路中的关键基因，通过影响查尔酮的产生从而影响黄酮类化合物的生物合成［4］，而黄酮类化合物的缺乏/过量是植物雄性不育的重要原因之一。有研究将克隆自10个柑橘种质的CHS基因与温州蜜柑 ‘国庆4号’Citrus unshiu‘Guoqing 4’， 柚 ‘冯威’Citrus maxima‘Fengwei’和甜橙 ‘红宝石’Citrus sinensis‘Ruby’的CHS比对，发现不同品种柑橘的CHS基因编码区核苷酸序列相似度极高，达98%以上［8］。本研究以前期工作为基础，以克里曼丁橘Citrus clementina数据库为参照，对 ‘无子瓯柑’和瓯柑小孢子母细胞时期的花药进行转录组和蛋白质组测序，筛选CHS同源差异表达基因进行克隆和表达量分析，并对CHS基因家族进行生物信息学分析，以期为 ‘无子瓯柑’雄性不育机理的深入研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 数据源 ‘无子瓯柑’和瓯柑小孢子母细胞时期的花药转录组测序数据源自课题组上传的NCBI数据（NCBI登录号 PRJNA）。

1.1.2 材料 ‘无子瓯柑’和瓯柑采自浙江省丽水市富岭街道南寨自然村，采样时间参照前期研究［9］。采集 ‘无子瓯柑’和瓯柑成熟时期的花蕾进行基因克隆。采集两者小孢子母细胞时期（Ⅰ，花蕾直径2.0～2.4 mm）、减数分裂时期（Ⅱ，花蕾直径2.4～2.8 mm）和四分体时期（Ⅲ，花蕾直径 2.8～3.1 mm）的花药，用于分析不同发育时期的基因表达量。采集两者成熟花粉粒时期花蕾（花蕾直径6.5～6.9 mm）的4个不同部位（花药、花丝、雌蕊和花瓣），用于分析不同部位的基因表达量。所有材料均保存于-80℃。

1.2 基因克隆和基因表达量分析

利用RNA提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，TaKaRa）提取瓯柑、 ‘无子瓯柑’不同发育时期的花药和成熟花粉粒时期花蕾不同部位的RNA，并对RNA样品质量进行检测。按反转录试剂盒（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa）说明书，将得到的RNA反转录成cDNA，并于-20℃保存。

以克里曼丁橘基因组数据库为参考，对小孢子母细胞时期 ‘无子瓯柑’和瓯柑的花药进行转录组和蛋白质组分析，鉴定得到CHS基因家族成员；以差异表达倍数（FC）＞1.2，错误发现率（FDR）＜0.01为标准［10］，筛选到CHS同源差异表达基因；以差异表达倍数（FC）＞1.2，假设概率（P）＜0.05为标准，筛选CHS同源差异表达蛋白。

对得到的差异表达CHS基因进行克隆及定量引物设计。对 ‘无子瓯柑’和瓯柑的CHS基因的蛋白质编码区（CDS,Coding Sequence）进行克隆。聚合酶链式反应（PCR,Polymerase Chain Reaction）程序为95℃，5 min；95℃，30 s，56℃，40 s，38个循环；72℃，10 min。PCR产物在质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶上电泳。利用胶回收试剂盒（TaKaRa）纯化胶回收产物并连接到pMD-18质粒（TaKaRa），转化感受态大肠埃希菌Escherichia coliDH5α（TaKaRa）中，37℃震荡培养后涂板挑菌。通过菌液PCR及电泳检测后，选出条带大小正确的菌液送生工生物工程（上海）有限公司测序，获得基因的核苷酸序列。

以克里曼丁橘序列为模板，在线设计qRT-PCR特异性引物（ sinensis的Actin基因（GU）［9］为内参基因，引物序列由生工生物工程（上海）有限公司合成。利用CFX96 real-time system实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad）及荧光染料SYBRPremix ExTaqTMⅡ（TaKaRa）说明书进行实时定量PCR，反应程序为95℃，30 s，95℃，5 s，57℃，30 s，39个循环，65～95℃升温检测扩增产物的溶解曲线［9］。设置3个重复，根据2-△△Ct方法，以瓯柑小孢子母细胞时期花药的表达量为基准计算基因相对表达量［11］，比较 ‘无子瓯柑’和瓯柑在花药不同发育时期和花粉粒成熟期花蕾不同部位的基因表达量。

1.3CHS基因家族生物信息学分析

柑橘CHS基因编码区核苷酸序列相似度极高［8］，因此以克里曼丁橘为例开展CHS基因及蛋白质的生物信息学分析。登录克里曼丁橘数据库，下载CHS基因全长序列、基因CDS序列、家族蛋白序列等信息。所有蛋白质序列通过在线数据库ExPASY（ thaliana（ satava（

文章来源：《园艺学报》 网址: http://www.yyxbzz.cn/qikandaodu/2020/1020/368.html

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